李晗 张鑫 鲍树森 郝强

【摘 要】 成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统,通过其转录产物crRNA(CRISPR RNA)及CRISPR相关蛋(CRISPR-associated,Cas),尤其是Cas9蛋白特异性抑制入侵的DNA。该系统由于其快捷靶向以及其作为一种特定位点核酸酶的高效性和多重修饰的可能性,被广泛应用于基因编辑领域。本文主要从CRISPR/Cas9系统的相关概念及原理、技术研究进展、应用研究进以及CRISPR/Cas9技术应用的未来发展进行阐述。

【关键词】 CRISPR CRISPR/Cas Cas9 基因编辑

基因编辑是指对基因组或表达产物(RNA)进行针对性修饰的过程。真核生物基因组包含上亿万个碱基,很难对其进行精确的修饰。但如果能够简单有效地做到,将会极大地推动生物学基础理论、医药及生物技术等方面的研究的进展。CRISPR/Cas9作为新一代的基因编辑技术,有着其它技术无可比拟的优势。理论上,在基因组中每8bp就有一个适合 CRISPR/Cas9编辑的位点。基于CRISPR/Cas系统的作用原理,研究人员通过体外人工合成sgRNA(small-guide RNA)与Cas9蛋白的复合物,成功实现对特定基因片段的精确剪切,由此开创了一种通过构建RNA序列介导Cas蛋白识别并剪辑靶基因的新型基因编辑技术。由于该技术的高效性、低成本性和简易性,对于CRISPR/Cas9系统的研究受到各界密切关注,而且在越来越多的研究领域得到应用。

1 CRISPR/Cas9技术的基本原理

CRISPR/Cas9的基本结构包括tracrRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)序列区、cas(CRISPR associated system,cas)基因序列区、CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)序列区,3个功能区在

DNA链上呈线性排列。CRISPR序列区含多个重复序列(R区)和间隔序列(S区),间隔序列被呈半回文结构的重復序列隔开。CRISPR序列区可编码crRNA(CRISPR RNA),故又被称为crRNA序列区。Cas基因区临近CRISPR序列区,cas基因种类有很多,其中cas9 基因编码Cas9核酸酶,该酶受crRNA引导,对DNA靶序列进行切割。CRISPR/Cas系统分为三种类型:TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ,而在化脓链球菌中发现的CRISPE/Cas9系统属于TypeⅡ型。

CRISPR/Cas9系统在噬菌体中起到免疫作用,当噬菌体首次入侵宿主时,cas基因编码的蛋白复合物会裂解噬菌体DNA上短间隔序列,并将裂解片段整合入自身DNA的CRISPR序列5端。当同种噬菌体再次侵入时,整合了噬菌体DNA片段的CRISPR位点会转录出crRNA,在crRNA与一段tracrRNA结合成为二元复合体后,与噬菌体DNA 20nt 的长度互补配对,继而引导Cas9核酸酶切割结合位点[1]。

2 CRISPR/Cas9技术的新发展

Samuel等[2]建立了一个模块化的存储单元,利用自我靶向RNA(stgRNA)记录细胞内分子事件,从而使它能被反复的改写来生成新的序列。他们设计了一个自我靶向向导RNA(stgRNA),它可以不断地靶向、诱变编码它的DNA。在巨细胞病毒启动子和规范ATG起始密码子的下游,他们嵌入了一个突变检测区(MDR)。这个可变区是由stgRNA位点和紧随它的改良后的u6启动子组成。MDR直接在不同阅读框的绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)基因后面,GFP和RFP被相应的不同阅读框的“2A自我分裂(切割)多肽”分开。不同的阅读框架是否与起始密码子同框,这取决于MDR中插入缺失的大小。不同数量的碱基删除会产生不同的移码突变,从而表达不同的荧光蛋白。进而记录细胞内分子事件。

在基因编辑技术方面,CRISPR/Cas9系统以其简洁性、高效性已被广泛用于基因编辑,但同时也存在着脱靶的现象。Feng Zhang等[3]在构成化脓性链球菌 Cas9酶的约 1400个氨基酸中,通过改变 3个氨基酸将“脱靶编辑”显著减少至无法检测到的水平。该研究小组将这种新设计的酶命名为 “增 强 型 ”化 脓 性 链 球 菌 Cas9 (SpCas9),可用于需要高水平特异性的基因组编辑应用。

3 CRISPR/Cas9技术在疾病研究中的应用

3.1 疾病模型的构建

目前,许多遗传病的研究是通过对来自患者的iPS细胞的研究来实现的,但是这要花费几个月的时间,同时也受到细胞是否可以得到和遗传背景多样性的限制。这一问题可以通过野生型细胞系的基因编辑来避免。Dominik[4]等利用CRISPR/Cas9引入阿尔兹海默氏症的任意一种遗传突变后,发现在CRISPR/Cas9切割位点和研究者引入受体细胞的突变之间存在一段序列上的距离。研究者发现了特殊的距离关系,就可以对干细胞的基因组进行编辑使细胞包含两种阿尔兹海默氏症基因中的任意一种,随后诱导这些干细胞转化成为神经元细胞并且产生大量β淀粉样蛋白,从而模拟阿尔兹海默氏症的疾病表现。

3.2 疾病的治疗

目前,病毒治疗的策略相对有限,而CRISPR/Cas9系统对病毒DNA的清除为病毒的治疗提供了新的思路。Kaminski R等[5]证实利用CRISPR基因编辑系统能够有效地和安全地将HIV病毒从在体外培养的人T细胞的DNA中清理掉。我国军事医学科学院放射与辐射医学院研究所、第四军医大学西京医院、日本京都大学和华中农业大学兽医学院等处的研究人员研究靶向乙肝表面抗原(HBsAg)编码区的CRISPR/Cas9系统,在体外培养的肝细胞中和活的小鼠体内的效果[6]。结果表明,CRISPR/Cas9可在体内和体外抑制HBV复制和表达,可能是治疗HBV感染的一种新策略。

在遗传病防治方面,血友病B,是非常适合用于基因治疗与基因编辑技术的疾病。Guan Y等人[7]发现位于人类F9基因上的突变Y371D能够引起比Y371S更为严重的血友病。他们用靶向这一基因位点的CRISPR/Cas9系统对小鼠进行治疗,结果表明,用腺病毒为载体的基因编辑系统对小鼠基因纠正率较高,但有较重的肝毒性,需进一步改善。Elizabeth等[8]进行了人血液红系祖细胞的由CRISPR/Cas9介导的基因编辑,使得在HBG1和HBG2基因的启动子中的一段13nt的序列发生了突变,进而改变了天然存在的胎儿血红蛋白(HPFH)相关突变。而经过基因编辑的红系祖细胞与胎儿血红蛋白(HbF)水平的增加也足以抑制镰状红细胞贫血由于缺氧导致的红细胞形态的改变。这有可能是未来β-地中海贫血基因治疗的一项策略。

CRISPR/Cas9在肿瘤治疗方面的研究的主要策略是相关基因的敲除。2015年,Brandon等[9]首次将CRISPR技术应用到了癌症相关的基因治疗研究,他们设计了一种慢病毒载体使 CRISPR 系统可以被 doxycycline 进行诱导表达,并高效地对细胞进行编辑。应用这个系统,他们实现了对 癌基因MCL-1在体内和体外的敲除。实验结果表明,慢病毒 CRISPR/Cas9 系统高效地实现了体内 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑,通过癌基因的敲除,可以作为一种潜在的新型的癌症治疗方案。CRISPR/Cas9技术在体外敲除EGFR/EGFRvIII,增加了 UBXN1的表达同时减少了NF-κB的表达,最后抑制了成胶质细胞瘤(GBM)的生长。

4 发展前景展望

随着CRISPR/Cas9技术的日益发展与完善,它在科研的基因编辑领域发挥重要作用的同时,也将会给临床治疗提供一个崭新的思路,尤其是在抗DNA病毒感染和肿瘤治疗方面。隨着靶向RNA的CRISPR系统的发现,也为抗RNA病毒感染提供了新的思路。

参考文献

[1].Jiang, W., et al. Nucleic Acids Res, 2013. 41(20): p. e188.

[2].Perli, S.D., C.H. Cui, and T.K. Lu. Science, 2016. 353(6304).

[3].Slaymaker, I.M., et al. Science, 2016. 351(6268): p. 84-8.

[4].Paquet, D., et al. Nature, 2016. 533(7601): p. 125-9.

[5].Kaminski, R., et al. Sci Rep, 2016. 6: p. 22555.

[6].Zhen, S., et al. Gene Ther, 2015. 22(5): p. 404-12.

[7].Guan, Y., et al. EMBO Mol Med, 2016. 8(5): p. 477-88.

[8].Traxler, E.A., et al. Nat Med, 2016. 22(9): p. 987-90.

[9].Aubrey, B.J., et al. Cell Rep, 2015. 10(8): p. 1422-32.